抗体细胞因子的融合，要求它针对肿瘤细胞的活性和有效性，强于单独用抗体或单独用细胞因子的效果，联合用药可以达成更好的效果。因此，最好在相关同基因的免疫活性动物模型中，验证融合蛋白的效果。
最好的医生就是你自己，就在人体内，他就是健康的免疫系统。
2018年被受关注的诺贝尔生理学或医学奖，让“免疫负调控”的发现者詹姆斯·艾利森和本庶佑声名显赫。“免疫负调控”发生在抗原呈递期间，即初始T细胞与抗原呈递细胞之间传递抗原信号，以及细胞识别期间，即效应T细胞迁移进入肿瘤组织，与肿瘤细胞或免疫细胞之间传递识别信号期间。
大部分肿瘤细胞就是充分利用“免疫负调控”，来抑制细胞毒性T细胞的免疫活性，从而逃避免疫系统的追杀。具体地说，在正常状态下，当炎症反应发生时，NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞，以及表皮细胞和血管内皮细胞表面会被诱导表达PD-L1蛋白。当这些细胞和被激活的T细胞接触时，PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞的免疫活性，避免过激的炎症反应对自身的伤害。因为这些细胞表面表达的PD-L1程度比较低，所以可以避免对T细胞活性的消耗。然而肿瘤细胞大不一样，它们在细胞表面大量表达PD-L1，能够几乎完全抑制与它们接触的所有T细胞的免疫活性，造成T细胞活性耗竭，并逃避免疫系统的追杀，最终恶性繁殖扩增，危及生命。
目前，肿瘤的联合免疫疗法越来越体现出它的优越性。一方面，要减少肿瘤靶向结合的非特异性，减少治疗过程对正常细胞的杀伤，我们需要尽可能地将免疫系统引起的细胞毒性局限在肿瘤组织中（靶向药物）。另一方面我们需要解除肿瘤细胞和免疫细胞之间的免疫负调控，提高免疫细胞对肿瘤细胞的细胞毒性（免疫负调控抑制），使肿瘤杀伤单抗药物的肿瘤杀伤作用更能发挥威力。
在这些治疗方案中，都以T细胞免疫为核心。虽然细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤作用具有一定的特异性，然而极优而劣。因为细胞毒性T细胞的特异性，来源于被杀伤细胞的MHC-I型抗原递呈。只有识别了目标细胞通过MHC-I递呈的抗原，细胞毒性T细胞才能特异性的杀伤靶细胞。然而，狡猾的肿瘤细胞，有相当一部分关闭了其细胞表面MHC-I类分子的表达，比如，92%的宫颈癌细胞，71%的乳腺癌细胞，64%的非小细胞肺癌细胞。这样我们英勇无比的细胞毒性T细胞，对它们就无能为力了。
“如之奈何？”
幸运的是，对付这类狡猾的肿瘤细胞，我们有免疫系统的另一杀手，自然杀伤细胞（Natural Killer Cell， NK细胞）。
NK细胞，即自然杀伤细胞，是一种具有细胞毒性的淋巴细胞，属于天然免疫系统。NK细胞与获得性免疫系统中的细胞毒性T细胞，扮演着相近的角色。NK细胞对病毒感染的细胞，或者肿瘤形成，有着极快的响应速率。通常情况下，免疫细胞检测到感染细胞表面的MHC，引起细胞因子的释放，进而导致靶细胞裂解或凋亡。但NK细胞有所不同，它们可以在没有抗体或MHC的情况下，识别这些细胞并进行快速的免疫响应。对于那些失去自身标记的MHC-I型的细胞，NK细胞不经过激活就可以进行杀伤。而这些细胞通常是有害的，不能被其他免疫细胞发现并消灭。
尽管NK细胞并不需要肿瘤相关抗原识别，来调整抗肿瘤的响应，但NK细胞同样存在免疫检查点的激活或抑制机制。虽然目前在细胞因子治疗方法，以及NK细胞过继转移等方面有所进步，但是，肿瘤细胞表达的针对NK细胞免疫检查点的配体，仍然能够抑制NK细胞介导的肿瘤细胞裂解。于是NK细胞功能缺失，肿瘤逃逸，病情加剧。因此目前有一些新的药物被研发出来，针对肿瘤-NK细胞的抑制型免疫检查点，以限制这种抑制作用。
当细胞在病毒感染向肿瘤转化期间，产生了应激压力或DNA损伤，就会产生胚系编码配体（germ-line ligand），这些配体可以被NK细胞表达的胚系编码受体（germ-line receptor）识别。而当细胞出现低表达MHC-I的情况时，就会触发“丢失自我”杀伤机制。因此为了最大程度地减少对正常细胞或组织的杀伤，必须微妙的平衡这种激活或抑制的信号，以调节NK细胞的活性。
肿瘤细胞分裂期间，一定程度地引起DNA损伤，这会诱导NKG2D和DNAM-1的表达，进而引发NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。然而，肿瘤细胞可以通过上调非经典的MHC-I，即HLA-G的表达，结合NK细胞的抑制型受体LIR-1，规避NK细胞的识别和杀伤。同时，肿瘤细胞也可以通过可溶性的NKG2D的配体，规避杀伤。这些配体通过可变剪切的方式，从肿瘤细胞表面脱落。于是NK细胞难以通过激活型受体NKG2D与其配体结合，也就难以激活对肿瘤细胞的杀伤。同时，这些可溶性的NKG2D配体，可以结合远处近处的NK细胞的NKG2D激活型受体，使其处于持续激活状态，而降低了NK细胞识别的敏感性。
一些位于肿瘤微环境中的抑制型免疫细胞，比如骨髓衍生抑制细胞（MDSCs）、调节型T细胞（Treg）可以抑制NK细胞的抗肿瘤活性。MDSCs通过分泌抑制型细胞因子IL-10和TGF-β，其中TGF-β可以下调NK细胞表面NKG2D的表达，或者通过细胞接触的方式，抑制NK细胞的活性。同样的，Treg也可以通过膜表面的TGF-β抑制NK细胞的活性，且Treg也通过竞争性消耗IL-2以减少IL-2对NK细胞的激活。
NK细胞可以通过两种方式克服抑制，一是激活型细胞因子，比如IL-2、IL-15，二是CD16（FcγRIII）介导的NK细胞激活。IL-2和IL-15共享相同的βγ-受体亚基，而各自的α受体亚基可以提高它们在受体上的亲和力，它们结合对应的高亲和或中亲和受体，激活JAK-STAT信号通路，最终诱导更多的细胞因子的表达，细胞毒性的效应功能，以及增殖和存活。
IL-2治疗已经被大量研究，但是单独使用IL-2所产生的疗效并不显著。IL-2的一项缺点是，尽管它能够激活NK细胞，但同时，它也可以增强Treg的活性，限制NK细胞的响应。高剂量IL-2治疗肾癌或转移性黑色素瘤，只能让小部分患者的病情缓和，并且残留有大量细胞毒性。因为低剂量的IL-2更利于激活Treg的功能，所以IL-2治疗受限，而IL-15对于NK细胞依然有较好的刺激效果，且不会激活Treg的功能。
IL-15被用于实体瘤的治疗，以及在白血病患者中，维持NK细胞数量和活性。临床前、非人类哺乳动物以及早期临床的数据都表明，IL-15可以诱导NK细胞数量上升。其中IL-15与IL-15Rα的反式呈递，对最大化IL-15功效是必要的。ALT-803（IL-15N72D/IL-15Rα-Fc超级激动剂），在最近针对卵巢癌的鼠模型研究中，使NK细胞非常显著地去颗粒化，并导致细胞因子的大量产生。如ALT803能够使卵巢癌患者腹水中的NK细胞恢复活性。同时，在抗CD20抗体的联合作用下，ALT803增强了CD16引发NK细胞对B淋巴细胞的清除。IL-15一方面能够协助越过免疫检查点的抑制机制，另一方面能够完善NK细胞上CD16介导的功能，因此它成为了新的热门免疫治疗靶点。
CD16a，即FcγRIIIa，NK细胞表达的Fc低亲和受体，介导抗体的直接杀伤ADCC。CD16a表达在CD56dim的NK细胞上，这些NK细胞在健康个体内，占有至少80%的所有外周的NK细胞。CD16a与Fc结合后，通过ITAM信号通路，导致细胞因子的产生和细胞的去颗粒化。与NK细胞的其他激活型受体不同，CD16a与Fc的结合不需要协同激活，就可以产生强力的响应，这也使得NK细胞能够在病毒感染和肿瘤形成早期，通过抗体产生免疫反应。然而，NK细胞表达的CD16a对不同抗体的Fc亲和力有所差异，介导的ADCC的效果参差不齐。因此，开发BiKE和TriKE之类的分子，能改进亲和力，并且可以针对不同的肿瘤相关抗原。
激活NK细胞、解除NK细胞的免疫抑制、限制NK细胞毒性的时空。
新的针对NK细胞的研究，比如仿照BiTE思路而来的BiKE（图6），以及仿照CAR-T思路的CAR-NK（另文描述）。BiTE加上抗PD-1的部分成为了CiTE（检查点抑制T细胞连接抗体），那么BiKE加上了IL-15的部分而成为了TriKE
如果说，TriKE给我们提供了增强NK细胞的免疫响应和特异性的参考，那么如何武装NK细胞，是可以关注的点。一方面，抑制NK细胞的抑制性信号通路，比如抗体阻断NK细胞表面的抑制型受体，或者激活NK细胞，通过结合激活型受体的配体，比如IL-2、IL-15、Fc等；另一方面，提高NK细胞，尤其是渗透到肿瘤组织的NK细胞的有效性，提高针对肿瘤细胞的特异性，比如利用抗肿瘤的单抗。那又如何将这几方面的优势综合起来“武装”NK细胞？
细胞因子对肿瘤的治疗效果，因为受到药物传递的限制，无法在肿瘤病灶部位产生足够的活性，比如之前提到过IL-2的局限性。为了最大化细胞因子的治疗效果，重组的抗体-细胞因子融合蛋白被广泛研究，以增强单抗靶向肿瘤的能力。如此，细胞因子通过单抗，被引导至特异性的肿瘤部位，能够刺激引发更多有效的抗肿瘤响应，并且避免单独使用细胞因子时会造成的系统性的细胞毒性。
细胞因子是多肽或蛋白质，在重组基因表达上，容易实现在哺乳动物细胞中的表达，只需将INFs、ILs之类的融合在抗体的N端或C端。比如罗氏在研的RG7813（图10），包含抗CEA单抗，且其中一条重链的C端融合改造后的IL-2。同样的，前文提到的TriKE，基于scFv抗体，以拉近NK细胞和肿瘤细胞，并通过融合细胞因子激活NK细胞的活性。
设计理想中的抗体-细胞因子融合蛋白，包括以下步骤：
选择合适的靶向抗原：在正常组织中表达量极低的肿瘤相关抗原，以减少抗体“沉没”在正常组织中而无法发挥药效，同时也需要肿瘤组织中尽可能高表达，以便富集足够多的细胞因子。细胞表面的抗原，结合后不会被细胞吸收，这样可以延长融合细胞因子的半衰期。肿瘤微环境相关抗原也可以，比如与肿瘤迁移、浸润相关的细胞因子。在血液循环中没有显著的数量，比如sCEA，能够持续性消耗激活的免疫细胞，使这些免疫细胞无法造成有效杀伤。
选择合适的细胞因子：考虑细胞因子靶向到肿瘤细胞的目的，还没有一种单一的细胞因子具有所有的抗肿瘤的特性。是为了激活和辅助增殖T细胞、NK细胞还是巨噬细胞？是否需要直接作用于肿瘤细胞，还是用于抑制肿瘤组织血管的形成？细胞因子介导的杀伤机制，诱导T细胞的细胞毒性，还是ADCC，还是直接作用？本文优先考虑对NK细胞的激活作用。
结构的选择：完整的抗体结构，scFv，Fab等等。
融合细胞因子的生物活性：通过定量比较，维持完全的亲和力和生物活性，或者减弱活性以减少脱靶造成的系统性细胞毒性。正常组织中，过高的亲和力可能导致细胞毒性。而结合到靶细胞后，也要注意抗体介导的巨噬细胞吞噬，除非细胞因子靶向作用于巨噬细胞。这会使融合的细胞因子被巨噬细胞吞噬和消除。因此，如果用到了Fc融合，Fc往往需要通过改造以减少细胞因子的非特异消耗。
PK和PD：足够长的半衰期，以便于在肿瘤部位富集。
临床前药效估计：在肿瘤模型动物实验中，检测抗肿瘤药效和免疫毒性。
剂量和使用规划：在肿瘤微环境以及宿主的免疫效应细胞的条件下，基于耐受性和药代的效果制定。
结尾
抗体细胞因子的融合，要求它针对肿瘤细胞的活性和有效性，强于单独用抗体或单独用细胞因子的效果，联合用药可以达成更好的效果。因此，最好在相关同基因的免疫活性动物模型中，验证融合蛋白的效果。
最后，以TriKE的构建理念为结尾，一方面靶向肿瘤细胞，一方面靶向NK细胞，激活NK细胞或者解除NK细胞的免疫抑制（PD-1），然后通过IL-2或IL-15的改造体激活NK细胞的活性。如果融合的细胞因子，在TriKE功能的基础上，活性可限制在肿瘤微环境中释放，而且本身在血液循环中有较长的半衰期，这比TriKE更为理想。
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